骨肉瘤的端粒酶表达与化疗耐药的关系

骨肉瘤的端粒酶表达与化疗耐药的关系

梁 军   蔡宣松

上海 200065，同济大学附属同济医院骨科

[摘要]目的：研究骨肉瘤的端粒酶表达与化疗耐药、多药耐药基因(mdr1)、以及细胞凋亡抑制基因(bcl-2)表达的相关性，探讨骨肉瘤端粒酶的表达在化疗耐药中的作用。方法：49例骨肉瘤石蜡标本以原位杂交检测其端粒酶、mdr1mRNA的表达，以免疫组化（S-P法）检测其bcl-2蛋白的表达，结合临床分析骨肉瘤的端粒酶表达活性与化疗耐药以及与mdr1和bcl-2表达的关系。结果：49例骨肉瘤端粒酶的表达活性与化疗耐药负相关，与bcl-2表达活性正相关，而与mdr1表达不相关。结论：骨肉瘤端粒酶的表达与肿瘤化疗耐药有关，机理可能在于端粒酶与bcl-2间的相互协同作用，而与mdr1表达无关。

       [关键词] 骨肉瘤; 端粒酶; 多药耐药; 化疗

The expression of telomerase and its relationship with chemotherapy resistance in osteosarcoma. LiangJun, Cai Xuan-song. Orthopaedic department of TONGJI hospital,TONGJI university. Shanghai  200065

     [Abstract] Objective: To study the correlation among the telomerase activity and chemotherapy resistance and multidrug resistance gene(mdr-1) and bcl-2 in osteosarcoma ,and to evaluate the role of the telomerase activity in osteosarcoma chemotherapy resistance . Methods: By using in situ hybridization, the expression of telomerase and mdr-1 were observed in 49 paraffin sections of osteosarcoma. This 49 paraffin sections were also examined the expression of bcl-2 by using immunohistochemistry. Furthermore, the relationships of telomerase activity and chemotherapy resistance and multidrug resistance gene(mdr-1) and bcl-2 were analyzed.  Results: The expression level of telomerase in osteosarcoma showed a negative correlation with chemotherapy resistance, and a positive correlation with the expression of bcl-2. There was no relation between the expression level of telomerase and the expression of mdr1. Conclusions: The expression of telomerase is correlated with chemotherapy resistance, its mechanism could be lay in the synergism of telomerase with bcl-2.

   [Key Words] Osteosarcoma; Telomerase; Multidrug-resistance; Chemotherapy

 近年来有关端粒、端粒酶在肿瘤形成过程中的作用及其在临床应用中的价值正越来越受到重视。研究发现^[1]端粒是细胞染色体末端一段富含鸟嘌呤(G)的DNA重复序列，端粒长度的维持是由端粒酶合成的，端粒酶由RNA亚单位和蛋白亚单位组成，可以自身的RNA亚单位为模板，蛋白亚单位为逆转录酶进行催化，合成染色体末端的端粒，这是多数肿瘤细胞具有永生性、肿瘤组织能无限增殖的基础。端粒、端粒酶与细胞的生长、凋亡密切相关。

化疗药物对肿瘤细胞的抑制是通过诱导细胞凋亡来实现的，因此，我们推测端粒酶对肿瘤细胞DNA的保护作用可以抵抗由化疗药物引起的肿瘤细胞凋亡，从而在肿瘤化疗耐药中发挥作用。为探讨骨肉瘤端粒酶的表达活性在肿瘤化疗耐药中发挥的作用及可能的机制，本文采用原位杂交和免疫组化（S-P法）检测骨肉瘤石蜡标本的端粒酶、mdr1和bcl-2的表达，结合临床分析骨肉瘤的端粒酶表达活性与化疗耐药以及与mdr1和bcl-2表达间的相关性。

材料和方法

一、骨肉瘤标本  本组49例高度恶性骨肉瘤组织的石蜡标本均来源于我院1991年~2000年间诊治过程相近、有完整病案资料的四肢骨肉瘤患者，术中切取肿瘤组织，中性福尔马林液固定，石蜡包埋，蜡块标本5um连续切片，一张HE染色作参照，余作原位杂交及免疫组化用，切片经两位有经验的病理科资深医师复核。49例骨肉瘤组织学分类：骨母细胞型骨肉瘤39例，软骨细胞型骨肉瘤6例，纤维母细胞型、血管扩张型骨肉瘤各2例。

另取正常骨组织石蜡标本和骨软骨瘤组织石蜡标本各10例，分别作为正常组织和良性骨肿瘤的实验对照。

二、临床材料  49例骨肉瘤患者，男性23例，女性26例，平均年龄16.2岁（8岁~46岁）。治疗过程均为术前化疗-手术-术后化疗。术前化疗1~2次，化疗方案以大剂量氨甲喋呤（HD-MTX-CF）为主的综合化疗，MTX单次剂量8~12g/m²，联合阿霉素（ADM，50~60mg/m²次）、长春新碱（VCR，2mg/次）、环磷酰胺（CTX，15~20mg/Kg）、顺铂（DDP，3~4mg/Kg）等，化疗间隔2~3周。手术方案以Enneking分期和术前化疗反应为基础选择保肢或截肢术。术后增加新药或/和加大药物剂量继续化疗，第一年化疗间隔2~3周，第二年每2~3月化疗一次至术后2年结束。详尽记录化疗反应，化疗后一周复查AKP，以化疗后①AKP降至正常或AKP下降1/2以上②疼痛减轻、肿瘤变小变软③肿瘤临近关节活动度增加，局部皮温下降为肿瘤细胞对化疗反应良好^[2]。49例患者中22例肿瘤化疗反应好，27例欠佳。

三、实验方法

（一）原位杂交  端粒酶(TERT/TP-1)mRNA和mdr1mRNA原位杂交试剂盒均购自浮士德公司，即用型。

    原位杂交过程参照试剂盒说明书进行，以缓冲液代替探针作阴性对照实验。

（二）免疫组化  Bcl-2免疫组化试剂盒均购自北京中山公司，即用型。

    免疫组化过程参照试剂盒说明书进行，以缓冲液代替一抗作阴性对照实验。

（三）实验结果评定^[3]  显微镜下细胞不显色为阴性(﹣)；阳性信号表现为棕褐色，弱阳性(﹢)：细胞信号面积<25%，阳性(﹢﹢)：细胞信号面积25%~50%，强阳性(﹢﹢﹢)：细胞信号面积>50%。

四、统计分析方法   数据以SAS6.12版软件统计计算，率的比较用卡方检验，Spearman法等级相关性分析。

结 果

一、骨肉瘤端粒酶的表达与化疗耐药的相关性 骨肉瘤端粒酶表达的阳性信号位于胞浆内，呈棕褐色（图1~3）。49例骨肉瘤标本中39例表达阳性，与正常组织、骨软骨瘤间端粒酶阳性表达率卡方检验χ²＝31.503，p=0.001，有极显著性差异。端粒酶的表达活性与肿瘤化疗反应的关系见表1。

表1：骨肉瘤端粒酶的表达与化疗反应的关系

 χ²＝8.603     p=0.003   有显著性差异 

 等级相关系数r_s=-0.43119   p=0.002  有统计学意义

二、骨肉瘤端粒酶的表达活性与mdr1表达的相关性  骨肉瘤mdr1表达的阳性信号位于胞浆内，呈棕褐色。端粒酶的表达活性与mdr1表达的关系见表2。

表2：骨肉瘤端粒酶的表达活性与mdr1表达的关系

等级相关系数r_s=0.13007    p=0.373   无统计学意义

三、骨肉瘤端粒酶的表达活性与bcl-2蛋白表达的相关性  骨肉瘤bcl-2蛋白表达的阳性信号位于胞浆内，呈棕褐色。端粒酶的表达活性与bcl-2蛋白表达的关系见表3。

表3：骨肉瘤端粒酶的表达活性与bcl-2表达的关系

等级相关系数r_s=0.45049      p=0.0012    有统计学意义

讨  论

一、           骨肉瘤端粒酶的表达与化疗耐药的关系

    以往骨肉瘤的治疗以截肢为主，但即使截肢，5年生存率也不过15%，原因在于手术前就存在远处肺部的微小转移灶。70年代后随着对化疗的重视，骨肉瘤的综合治疗取得了很大进步，成为骨肉瘤治疗的基本原则，尤其是新辅助化疗（neoadjuvant chemotherapy）研究的逐渐深入以及联合化疗的普及，越来越多的骨肉瘤患者得以保留肢体，5年生存率也由单纯手术的20%提高到60%以上，但仍有不少患者对化疗不敏感，预后不佳。化疗不敏感的原因很多，主要在于^[4]骨肉瘤对化疗耐药，而且一旦对某种化疗药物产生耐药，同时它也会对其他不同结构、不同作用机制的药物产生耐药，即所谓的多药耐药。骨肉瘤多药耐药包括原发性耐药（初次化疗阶段便对多种化疗药物无明显反应）和继发性耐药（化疗初期效果好，肿瘤细胞受到抑制，但几个疗程后肿瘤细胞对所用药物甚至其他未用药物产生耐药）。

 化疗药物对肿瘤细胞的抑制是通过诱导细胞凋亡来实现的，而肿瘤细胞的生长、凋亡与端粒、端粒酶有关，本文结果发现骨肉瘤不同化疗反应组间端粒酶阳性表达有显著差异，并且随端粒酶表达活性的增加肿瘤对化疗反应逐渐减小，提示骨肉瘤的端粒酶活性与化疗耐药有关，端粒酶的激活可能在骨肉瘤产生多药耐药过程中发生作用。原发耐药可能因为肿瘤细胞端粒酶活性强，催化合成端粒快，细胞增生超过化疗诱导的细胞凋亡；继发耐药可能由于化疗诱导肿瘤细胞的端粒序列渐缩短到一定程度而丧失功能时又激活端粒酶，增强了端粒酶活性，从而抵抗细胞凋亡。

二、           骨肉瘤端粒酶表达活性与mdr1表达的关系

肿瘤细胞产生多药耐药的机制复杂，包括靶基因突变、扩增，DNA损伤修复能力差，药物进入细胞内浓度下降等。目前认为多药耐药基因mdr1的扩增及其表达产物P170蛋白的高表达是导致肿瘤细胞耐药的主要途径，其耐药机制为细胞膜上P170分子形成ATP依赖性膜泵结构，可将化疗药物泵出细胞外，使细胞内药物浓度下降。本文结果mdr1表达活性与端粒酶表达活性间无相关性，提示端粒酶参与肿瘤耐药的机制与mdr1扩增无关。

三、           骨肉瘤端粒酶表达活性与bcl-2蛋白表达的关系

    研究表明不少因素可抑制细胞凋亡，这些因素的作用使细胞表现出对细胞凋亡的不敏感，也表现出对凋亡诱导剂的抗性。Bcl-2是最重要的凋亡抑制基因，其表型能明显抑制肿瘤细胞的凋亡，导致肿瘤细胞对化疗药物的耐受，而且，这种bcl-2介导的多药耐药性与多药耐药基因无关，作用机理可能与抑制野生型P53蛋白活性、抑制c-myc诱导凋亡、与Bax蛋白形成异聚体抑制其活性有关。Mandal等^[5]用bcl-2 cDNA质粒转染Hela细胞和人直肠癌细胞，发现转染阳性Hela细胞和直肠癌细胞的端粒酶活性分别升高5~10倍和8~12倍，提示bcl-2蛋白的过表达可能是端粒酶激活的重要途径之一。本文结果中骨肉瘤的端粒酶表达活性与bcl-2表达活性间呈正相关，提示端粒酶与bcl-2间可能存在相互协同作用，在肿瘤细胞尤其是恶性肿瘤细胞无限增殖中，端粒酶维持肿瘤细胞的生长、bcl-2抑制肿瘤细胞的凋亡，两者相互促进，共同发挥着重要作用，因此，可以推测通过激活端粒酶的表达对诱导细胞凋亡的抗性可能是骨肉瘤化疗耐药的另一种机制，端粒酶抑制剂可通过影响bcl-2的表达，从而提高化疗药物的效用，而细胞凋亡诱导剂也可通过抑制端粒酶表达，从而改善骨肉瘤的预后。