骨肉瘤端粒酶的表达及其与临床的关系

骨肉瘤端粒酶的表达及其与临床的关系

梁 军      蔡宣松

上海 200065，同济大学附属同济医院骨科

  [摘要] 目的：研究骨肉瘤端粒酶的表达，探讨骨肉瘤端粒酶的表达活性与临床特征的相关性。方法：原位杂交检测49例骨肉瘤石蜡标本及10例正常骨组织和10例骨软骨瘤石蜡标本的端粒酶表达活性，结合临床分析骨肉瘤的端粒酶表达活性与临床病理特征的关系。结果：49例骨肉瘤中端粒酶表达阳性39例（阳性率79.6%），而正常骨组织和骨软骨瘤端粒酶阳性表达率分别为0%和10%，有极显著性差异（p=0.001）；骨肉瘤端粒酶的表达活性与肿瘤的大小、病理分级、3年存活率等明显相关。结论：端粒酶在骨肉瘤中阳性表达高，有辅助早期诊断的意义；骨肉瘤端粒酶的表达活性可以作为骨肉瘤预后评判的有效指标。

          [关键词]  骨肉瘤；端粒酶；基因表达；原位杂交

The expression of the telomerase and its relation with clinical character in osteosarcoma. LiangJun, Cai Xuan-song. Orthopaedic department of TONGJI hospital,TONGJI university. Shanghai  200065

          [Abstract]  Objective: To study the expression of the telomerase, and to evaluate the relations with clinical character in osteosarcoma. Methods: With in situ hybridization, the expression of telomerase  were observed in 49 paraffin sections of osteosarcoma, 10 paraffin sections of normal bone tissues and 10 paraffin sections of osteochondroma.  Furthermore, the relationship of  telomerase activity and  patient’s clinical  character were analyzed. Results: The telomerase was detected in 79.6%(39/49) of the osteosarcoma, while in  normal bone tissues and osteochondroma , the positive rates of telomerase were only 0% and 10%, respectively. The positive detection of telomerase expression in osteosarcoma were significantly different from those in  normal bone tissues and osteochondroma (p=0.001). The expression level of telomerase activity in osteosarcoma correlated well with tumor’s location, surgical stage, pathological grade and the patient’s prognosis. Conclusions: Telomerase was significantly detected in osteosarcoma and may be a potential biochemical marker of diagnosis and prognonis for osteosarcoma and play an important role in the genesis and development of osteosarcoma.

 近有研究发现^[1]大多数正常的人体细胞中不表现端粒酶活性，而90％的肿瘤组织尤其是恶性肿瘤组织中可检测到端粒酶活性。本文采用原位杂交检测骨肉瘤组织石蜡标本端粒酶的表达活性，结合临床探讨骨肉瘤端粒酶表达活性的应用价值。

材料和方法

1.骨肉瘤标本  本组49例骨肉瘤组织的石蜡标本来源于我院1991~2000年间有完整资料的四肢骨肉瘤患者，手术中切取肿瘤组织，中性福尔马林液固定，石蜡包埋。蜡块标本5um连续切片。经两位有经验的病理科资深医师复核，49例骨肉瘤组织学分类：骨母细胞型39例，软骨细胞型6例，纤维母细胞型、血管扩张型各2例。39例骨母细胞型骨肉瘤按细胞分化程度分为I级11例，II级16例，III级12例。

 另取正常骨组织石蜡标本和骨软骨瘤组织石蜡标本各10例，分别作为正常组织和良性骨肿瘤的实验对照。

2.临床材料

2.1一般资料  49例患者，男性23例，女性26例，平均年龄16.2岁（8岁~46岁）；平均病程（起病到就诊间隔时间）4.3月（1月~18月）；肿瘤部位：股骨远端33例，胫骨近端8例，股骨近端4例，其余部位4例；Enneking分期：IIa 7例， IIb 34例， IIIb 8例；x线分型： 溶骨型11例，成骨型8例，混合型30例。

2.2治疗方法  49例骨肉瘤患者治疗过程均为术前化疗-手术-术后化疗。术前化疗1~2次，化疗方案以大剂量氨甲喋呤（HD-MTX-CF）为主的综合化疗，联合阿霉素、长春新碱、环磷酰胺、顺铂等，化疗间隔2~3周。手术方案以Enneking分期和术前化疗反应为基础选择保肢或截肢术。

2.3随访资料  49例患者随访≥3年有40例，3年存活19/40（47.5%），其中保肢术患者3年存活17/35，截肢2/5（两者间p>0.05）。

3.骨肉瘤大小的测定  肿瘤的大小以最长径表示，最长径从MRI测量。以肿瘤长径≥肿瘤所在骨直径5倍为大肿瘤^[2]，49例患者中大肿瘤27例，小肿瘤22例。

5.实验方法

5.1原位杂交  端粒酶(TERT/TP-1)mRNA原位杂交试剂盒和mdr-1mRNA原位杂交试剂盒均购自浮士德公司，即用型。原位杂交过程参照试剂盒说明书进行，以缓冲液代替探针做阴性对照实验。

5.2实验结果评定^[3]  显微镜下细胞不显色为阴性(﹣)；阳性信号表现为棕褐色，弱阳性(﹢)：细胞信号面积<25%，阳性(﹢﹢)：细胞信号面积25%~50%，强阳性(﹢﹢﹢)：细胞信号面积>50%。

6.统计分析方法   数据以SAS6.12版软件统计计算，率的比较用X²检验，等级相关性分析（Spearman法）。

结   果

1.骨肉瘤端粒酶的表达   端粒酶表达的阳性信号位于胞浆内，呈棕褐色（图1~4）。49例骨肉瘤标本中39例表达阳性，阳性率79.6%，而10例正常骨组织无阳性表达，10例骨软骨瘤组织有1例表达阳性(﹢)。骨肉瘤、正常组织、骨软骨瘤间端粒酶阳性表达率卡方检验χ²＝31.503，p=0.001，有极显著性差异。不同亚型骨肉瘤端粒酶的表达活性情况见表1。

表1：不同亚型骨肉瘤端粒酶的表达活性

χ²＝0.809      p=0.847     无显著性差异

2.骨肉瘤端粒酶的表达活性与临床病理特征的关系  骨肉瘤端粒酶的表达活性与临床特征的关系见表2。

表2：骨肉瘤端粒酶的表达活性与临床特征的关系

*等级相关系数r_{s病理分级}=0.41170    p=0.0092  有统计学意义

 等级相关系数r_s存活期=-0.37726    p=0.0164  有统计学意义

 等级相关系数r_s年龄=-0.40209     p=0.0042  有统计学意义

3.骨肉瘤端粒酶的表达活性与影像表现的关系
  骨肉瘤端粒酶的表达活性与影像表现的关系见表3。

表3：骨肉瘤端粒酶的表达活性与影像表现的关系

*等级相关系数r_s=0.48414    p=0.0004  有统计学意义

讨    论

1.端粒酶与骨肉瘤的发生发展

 近年来端粒、端粒酶已成为肿瘤研究中的热点。研究发现端粒是多数肿瘤细胞染色体末端富含G的DNA重复序列(5’-TTAGGG-3’)n，其重要功能在于维持染色体稳定和DNA的完整复制。端粒的长度与细胞可分裂的次数直接相关^[4]，当端粒随细胞分裂缩短到一定程度时便不能维持染色体的稳定，细胞即衰老、凋亡，因此，端粒与细胞的生长、凋亡有密切的关系。

 端粒的长度是由端粒酶催化合成的。端粒酶是专一的逆转录酶，由RNA亚单位和蛋白亚单位组成，能以自身的RNA亚单位为模板，蛋白亚单位为逆转录酶进行催化合成染色体末端的端粒，维持端粒长度和稳定，使细胞具有永生性。人类端粒酶包括三个主要部分：端粒酶RNA（hTR）、端粒酶RNA相关蛋白（TP1/TLP1）和端粒酶RNA催化亚单位（hTRT/hEST2）。端粒酶活化过程中，端粒酶RNA水平和蛋白质成分共同调节端粒酶的活性。

         研究表明端粒酶的过表达和端粒长度的稳定可造成细胞的永生性，而永生性是肿瘤细胞区别于正常细胞的重要特征之一，也是肿瘤生长和转移的关键。越来越多的组织包括90%的肿瘤组织尤其是恶性肿瘤组织端粒酶阳性率远远高于正常组织及肿瘤周围邻近组织，而大部分正常的人体组织细胞（除胚胎组织、生殖细胞和少数造血干细胞外）和良性肿瘤组织细胞不表达端粒酶活性，提示端粒酶与恶性肿瘤间有较高的相关性。Kido^[5]在诱发大鼠骨肉瘤时发现端粒酶的活性提高了18倍，本文结果发现端粒酶在骨肉瘤组织中有特异的阳性表达，与正常骨组织和骨软骨瘤端粒酶阳性表达有极显著性差异，而且，不同大小的肿瘤间端粒酶表达活性有显著差异，肿瘤的大小随端粒酶活性的增加而增加，表明随端粒酶活性的增加，肿瘤细胞增殖越快，导致肿瘤增大，提示端粒酶在骨肉瘤发生发展中起重要作用，端粒酶的激活可能是造成骨肉瘤恶性表型及维持肿瘤生长的重要因素。      

2.骨肉瘤端粒酶的表达活性与临床特征的相关性

 本文结果骨肉瘤端粒酶的阳性表达率远远高于良性肿瘤组织和正常组织，与良性肿瘤组织和正常组织端粒酶阳性率比较有显著性差异，提示端粒酶活性与骨肉瘤间存在较高的相关性。有报道某些良性肿瘤及癌前病变的组织中可检测到较低的端粒酶活性，化生组织和原位癌中也表达弱端粒酶活性，这种端粒酶活性仅为肿瘤组织端粒酶活性的1%左右，并且可能与组织恶变有关。本文1例骨软骨瘤端粒酶呈阳性表达，可能与此有关。

 肿瘤组织的病理分级与肿瘤细胞的分化、肿瘤的恶性程度有关，肿瘤病理分级越高，其分化越差，恶性程度越高，预后往往不良。本文结果端粒酶阳性率在不同骨肉瘤病理分级中有明显差异，并且病理分级随端粒酶表达活性的增高而升高，表明端粒酶活性与骨肉瘤恶性程度密切相关，端粒酶活性有可能成为判断骨肉瘤分化程度的辅助指标。肿瘤分化程度直接联系着预后，本文端粒酶表达阳性与否，骨肉瘤患者3年生存率结果存在显著差异，并且端粒酶表达活性与生存率密切负相关，随端粒酶活性的增加，3年生存率逐渐降低，提示端粒酶活性也可成为骨肉瘤预后的判断指标。

 肿瘤的临床分期被认为与肿瘤的进展可能相关，但有关它们与端粒酶活性间的关系研究结论不一，本文结果表明骨肉瘤的端粒酶表达活性与临床分期无关，端粒酶的表达活性与病程也无关，可能因为Enneking分期仅以解剖间室为界表示肿瘤进展，不能具体区分相同解剖间室肿瘤的进展和恶性程度。

骨肉瘤预后与患者年龄的关系一直存在争议，结论不同可能因为各组资料年龄段选择不同。本文中年龄与端粒酶的表达活性呈负相关，从端粒酶角度提示年龄具有预后意义，年龄越小，预后较差。

本文对端粒酶活性与骨肉瘤组织分型间关系的研究中发现端粒酶活性在不同组织学分型中差异无显著性，提示端粒酶在不同组织学类型的骨肉瘤发生发展过程中发挥的作用可能相近。端粒酶的表达活性与患者的性别及肿瘤部位、x线分型等无关，提示性别、肿瘤部位以及肿瘤x线分型不是影响端粒酶表达的主要因素，可能与骨肉瘤的恶性程度、发展速度无密切关系，端粒酶的表达活性不能用于骨肉瘤x线分型的判断。

本实验还表明以原位杂交检测骨肉瘤石蜡标本的端粒酶表达活性临床上实用、可行。