固有荧光在肿瘤临床上的应用
梁 军 蔡宣松
同济大学附属同济医院骨科（上海，200065）
1948年Figge等观察到恶性肿瘤组织可吸收荧光物质（卟啉），初步研究了活体组织的荧光特性与组织内部微观结构间存在的相应关系。1961年Lipson首次采用荧光内窥镜在临床上成功识别了肿瘤组织，此后，荧光在医学、尤其在肿瘤临床上应用的研究开始了新的阶段。80年代以来，随着激光、电子工业等其他相关学科的发展以及后来固有荧光肿瘤诊断仪的出现，固有荧光的肿瘤诊断技术在临床上得到广泛应用。
1.荧光物质
活体组织的荧光物质被一定波长的激光激发后，受激分子由激发态回到基态的过程伴有能量发射，发出荧光，荧光物质是发生荧光的基本条件。组织内源性荧光物质激发的荧光称固有荧光，也可引入外源性荧光物质激发外源性荧光。卟啉是1908年首批发现的荧光化合物之一。 1948年Figge在对240只有瘤小鼠和50只无瘤小鼠的研究中发现，所有肿瘤组织对卟啉有很强的亲和力。 1960年Wubleman等首次对组织中血卟啉水平进行了定量分析，他们看到血卟啉更多地聚集在肿瘤组织中，而肌肉组织中极少。1961年Lipson首次引入外源性荧光物质HPD（hematoporphyrin derivative, 一种血卟啉衍生物）识别15例食管、支气管癌取得成功，同时，他观察到肿瘤生长活跃的边缘区荧光强烈而中心坏死区荧光小，表明 HPD在肿瘤周缘聚集高。此后几十年，许多外源性荧光物质被相继研究、应用，其中大部分是血卟啉衍生物，它们可作为肿瘤荧光标志物，激发更明显的荧光，但由于引入外源性荧光物质可能发生过敏、创伤等副作用，外源性荧光更多地在肿瘤治疗中应用，而不作为常规的肿瘤诊断的方法。
组织内源性荧光物质主要有胶原、弹性蛋白、色氨酸、NADH、FAD等，研究表明[1]不同组织所含荧光物质种类、数量各不相同。由于固有荧光诊断技术无任何副作用，近年来，相关研究迅速深入，并出现了先进的固有荧光肿瘤诊断仪，通过描记固有荧光光谱，分析、鉴别组织生化结构，临床上取得了良好效果。 Lam[2]报告固有荧光在探测早期组织病变方面比外源卟啉更准确，Vo-Dinh[3 ]认为只有在应用固有荧光时，荧光诊断才真正无创。
2.固有荧光的特性
荧光可用于组织的诊断，缘于荧光特征对组织的生化结构很敏感，特定组织标本的固有荧光光谱包含着组织生化结构的信息，不同组织由不同分子结构构成，正常组织、肿瘤组织分子结构不同，它们的荧光光谱特征也不一样，根据这个特征，可以鉴别正常组织和肿瘤组织。固有荧光特征代表了组织的生化结构，组织生化结构的改变是引起固有荧光特征改变的主要原因[4]，同时 Andersson-Engels[5]报告产生荧光特征的荧光物质离照射表面的深度以及非荧光物质（主要为血红蛋白，它不能激发荧光，但可以吸收物质发射的光，引起组织荧光光谱产生异常的波峰或波谷[6]）的浓度和深度也会影响固有荧光的特征。Schomacker[7]研究肠腺瘤息肉荧光特征的结果证实了Andersson-Engels的研究，提示良性肿瘤与正常组织间荧光不同的可能的原因。
组织的NADH浓度以及FAD、FMN 的氧化还原状态是荧光特征的主要信息[8]，也有作者[9-10]报告由于离体组织内NAD+或NADH、血液成分及其氧化还原状态与活体组织不同，因此可能会影响其固有荧光，但具体离体时间和固有荧光影响程度之间的关系，作者没有详述。病理学上认为，组织离体2～4 小时后分子结构开始发生变化，因此，组织离体2～4小时内，可认为其固有荧光不会有特征性改变。
虽然由于采用不同的激发波长、研究对象不同而结果有所不同[11]，但恶性肿瘤组织的固有荧光多主要表现为卟啉物质的荧光特征。卟啉类物质对恶性肿瘤组织有选择性亲和并潴留其中，其原因仍不确定，有认为[12]是由于存在的肿瘤相关的细胞因子或肿瘤代谢产物对机体生化代谢产生重要的影响，导致血红蛋白分解产物——卟啉在肿瘤组织的聚集，或导致卟啉代谢紊乱产生；还有认为[13]是由于肿瘤细胞分化异常增殖快，竞争性地利用卟啉作为能量来源的载体等等。卟啉趋向生长旺盛的组织，除肿瘤外，其他如炎症组织、切口修复的边缘，Cothren [9]报告溃疡性结肠炎也表现为明显的卟啉聚集，导致荧光诊断的假阳性，临床上值得多加注意。
80年代初，开始有用单色紫外光激发包括牙、口腔、皮肤、食管、胃肠、支气管、子宫颈等组织的固有荧光来诊断不同病理状态的实验，结果表明正常组织的荧光比不正常组织的荧光要强，荧光可以作为一种方法用于组织诊断。Chung、Mahadevan [14,15]等在临床上也使用过多色光激发固有荧光用以鉴别脑、肺部的肿瘤，他们认为可以更准确地诊断组织结构。但单色光、多色光激发荧光诊断组织结构的差别未见报道，目前多数实验和临床用单色（λ=337nm）激光。国内研究活组织的固有荧光特性也自80年代初期开始，有关文献[11]报告了肿瘤组织发光特性和卟啉、蛋白复合物发光特性之间的关系，证实肿瘤组织有选择亲和卟啉的特性，为固有荧光的临床应用提供了坚实的基础。
90 年代后，固有荧光大量应用于临床妇科、皮肤科、五官科、消化道肿瘤的早期诊断，取得良好效果，证明了固有荧光作为组织诊断尤其是肿瘤诊断手段的可行性、可靠性。其可靠性用敏感性、特异性表示，敏感性是荧光实验阳性结果与病理阳性结果之比，特异性是荧光实验阴性结果与病理阴性结果之比。 Schomacker [7]报告荧光光谱鉴别瘤与非瘤组织的敏感性和特异性分别达80％、92％，Ramanujam[16]鉴别不正常组织敏感性和特异性分别达92％、90％，鉴别恶性肿瘤组织敏感性和特异性分别达87％、73％， Kapadia[17]用荧光光谱鉴别肠腺瘤和增生息肉敏感性和特异性分别达100％、84％，国内结果与此相似[18]。
3.固有荧光诊断肿瘤的方法
3.1 直接荧光目测法
荧光首次应用于临床即通过直接照射组织标本后，观察标本表面颜色来判定组织的良恶性。这种方法国内应用较多，常采用氮光源，结果为：癌变、间变或癌前病变组织表现为紫、紫兰或桔黄色，而正常或良性组织表现为兰白色，与病理结果符合率大约80％左右，该法简便、快速，组织表面照射5～10分钟后，约30 秒便可显色。
3.2 直接荧光光谱法
直接照射组织标本，通过固有荧光诊断仪描记荧光光谱图，根据波形特征判定组织类型。比较统一的评判标准为①组织的固有荧光光谱若在390nm～420nm中出现波峰， 则该组织为癌变或癌前病变。②组织的固有荧光光谱若在460nm～480nm有波峰，预设正常组织峰值为100，则小于正常组织峰值50％的为癌变组织，大于50％为良性病变。③组织的固有荧光光谱若在670nm～690nm有波峰，预设正常组织峰值为100，则大于正常组织峰值200％的为癌变组织，小于100％为良性病变。这种方法目前较常用，并常与目测法联合使用，综合评判结果符合率90％左右。
3.3 血清荧光光谱法
Aiken和Huie CW[19]发现肿瘤患者血清固有荧光特征与直接照射肿瘤标本的固有荧光特征相似，表现为卟啉类物质的荧光特征。该方法可用于肿瘤患者的筛选、术后的观察、监测等。
4. 固有荧光在肿瘤临床上的适用范围
4.1 早期肿瘤的诊断与鉴别诊断
固有荧光最常用于早期恶性肿瘤的诊断与鉴别诊断，它属于分子水平的诊断手段，理论上只要分子结构甚至组织结构发生改变，固有荧光就会发生特征性改变，但目前文献大多报告中、重度不典型增生、早癌的诊断可靠性高达90％以上，而中晚期癌肿由于肿瘤组织侵犯深，且常伴有坏死组织、粘液等覆盖表面，干扰固有荧光信息，使诊断可靠性减低，多数假阴性结果都是因为表面覆盖了尚正常的粘膜。
4.2 肿瘤边界的判定
荧光物质聚集于肿瘤边缘生长活跃的部位，表现为荧光强，而周围正常组织几乎没有荧光，因此固有荧光可明显地判定肿瘤组织边缘，帮助确定肿瘤切除范围或判定手术后组织切除边缘有无肿瘤残存。这方面的文献报告不多。
4.3 引导组织活检
固有荧光引导下的活检，即在固有荧光异常部位进行活检，与常规活检相比，Andress [5]得到更高的阳性检出率，而且受检对象创伤小。也有作者手术中利用固有荧光判定肿瘤淋巴结有无转移，符合率高，取得良好效果。
5. 固有荧光在肿瘤临床上应用的局限性
固有荧光诊断早癌是一种快速、方便、无创和较可靠的方法，目前常用的固有荧光肿瘤诊断仪多以单色光源（λ=337nm），用于检测粘膜型早癌包括口腔癌、胃肠癌、食道癌、宫颈癌等以及术中检测有无癌淋巴转移等，可靠性高达90％以上，临床上取得良好效果。固有荧光也可应用于肿瘤边界的测定、引导组织活检等，但它的结果并非绝对，而且有报告固有荧光对腺瘤和肺癌等的诊断失误率高，当其结果与病理结果不符时，应以病理结果为准。它目前对粘膜早癌的诊断可靠性高，但对中晚期肿瘤的可靠性较低，而且其他组织来源的肿瘤如肉瘤等的固有荧光特征，文献极少涉及。因此进一步提高固有荧光诊断肿瘤的符合率，深入研究不同组织来源的肿瘤的固有荧光特征以及以固有荧光来确定切除肿瘤范围的可行性、可靠性，固有荧光在肿瘤临床上的作用将更加明显。
